مقاله مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی

مقاله مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی در 50 صفحه ورد قابل ویرایش 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                            صفحه

بخش اول: دست كاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه................................................................................................................

1-1- به كار گیری پروموتر از ژن ماهیان.....................................................

2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باكتری...............................................

3-1-  انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میكروپیل با میكروپیپت.....................

4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انكوبه كردن آن در سیستم بافری...........

5-1- انقال ژن از طریق اسپرم با الكتروپورشن در سیستم بافری................

6-1- انتقال ژن  به تخم ماهی از طریق الكتروپورش.....................................

7-1-  انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میكروپیل با میكرواینجكشن..............

8-1- بررسی امكان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد.............................

بخش دوم : دست كاریهای كروموزومی در ماهیان

1-2- دست كاریهای جنسی.............................................................................

1-1-2- دست كاریهای جنسی با تكنیك ژینوژنز............................................

2-1-2- دست كاریهای مجموعه كروزومی به وسیله تكنیك اندروژنز..........

2-2- پلوئیدی...................................................................................................

1-2-2- تریپلوئیدی.........................................................................................

2-2-2- تتراپلوئیدی........................................................................................

بخش سوم: كلونینگ

مقدمه................................................................................................................

1-3- ایجاد كلون به وسیله دوژینوژنز متوالی................................................

2-3- كلون كردن به وسیله تركیبی از اندروژنز و ژینوژنز...........................

3-3- جابجایی هسته........................................................................................

4-3- جابجایی سلولهای سوماتیك جنینی به جنین دیگر.................................

5-3- دورگه گیری..........................................................................................

4- منابع............................................................................................................

بخش اول: دست كاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه:

یكی از زمینه های كه امروزه بیوتكنولوژیست ها روی آن تحقیق می كنند ایجاد گونه های ترانسژنیك است. طبق تعریف ترانسژنیك موجودی است كه، دارای DNA  نو تركیبی باشد. به طوری كه در ژنوم آن موجود ژن نو تركیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یكی از جنبه های تولید ترانسژنیك و انتقال DNA به زاده های  هدف بعدی می باشد. در این زمینه تكنیك میكرواینجكش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همكاران در سال 1980 گزارش شد. در این تكنیك یك لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد كردن DNA نو تركیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به كار گرفتند. در همین سال میكروانجكش مستقیم DNA نو تركیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیك مورد استفاده قرار گرفته است. طوری كه ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سركه، خرگوش و خوك كرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همكاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مركزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق كردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده كرند. در همین سال روكونس (Rokkones) تكنیك میكرواینجكشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تكنیك ابتدا به كمك یك وسیله نوك تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA  نو تركیب به كمك پی پت ریز تخم شدند به طوری كه به كیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای كامل را مشخص كردند. چوروت (Chourrout) و همكاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به كار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملكولهای DNA میزبان پیشنهاد شده كه این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از  جمله با تریپسن كوریون را برداشته و تزریق میكرواینجكشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی كوچك مدوكا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیك مطرح كرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن كریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میكرواینجكشن وارد كرد. به علت كوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میكرواینجكشن مشكل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور  روشهایی جهت غلبه بر این مشكل به كار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem)  و همكاران ژن هورمون رشد انسان را به كمك وكتور مناسب از طریق میكروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق كردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همكاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیك انجام شد. همچنین تكنیكهای دیگر شامل الكتروپورشن (Electroporation) شلیك ذرات ژن Shatagun بر روی تخمك و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میكر واینجكشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن كم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیك است علاوه بر این از دیگر مشكلات آن این است كه در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میكرسكوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم  تزریق می كنند.

در مجموعه تحقیقات انجام شده، میزان باقی ماندگی جنین هایی كه مورد تزریق قرار گرفته اند بین 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و كارآیی میزان بیان ژن بین 3 تا 70 درصد بوده است. باقی ماندگی جنین ها و كارایی بیان ژن وابسته به فاكتورهایی نظیر سیستم بافری، غلظت DNA  و روش های مورد استفاده در تزریق می باشد. لذا در مراحل بعدی غلبه بر این مشكلات مورد توجه قرار گرفت به طوری كه ضمن ساده كردن تكنك و كم كردن هزینه ها كارآیی را افزایش می دهند تا در عمل بتوان در تكنولوژی تكثیر و پرورش آبزیان تعداد زیادی از ماهیان ترانسژنیك را ایجاد كرد. بنابراین روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بكارگیری اسپرم به عنوان یك ناقل مسئله جدیدی نیست بلكه در سال 1971 براكت (Brackett) با وارد كردن ژن خارجی به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فریمن (Fareeman) بر روی ماكیان این تحقیق را انجام داده اند و در سال 1989 لویترانو (Lavitrano) این تكنیك را بر روی موش به كار گرفته است. در سال 1992 كهو (Khoo) تكنیك استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد كردن ژنهای جدید به ماهی زبر به كار گرفت. همچنین در سال 1993 ایكسی (Xie) و همكاران جزئیات انتقال ژن از طریق اسپرم به كمك التروپورشن (Electroporation) بر روی ماهیان لوچ (Loach) و كاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سین) Sin و همكاران انتقال ژن به ماهی چنوك (Chinook) را با همین تكنیك شرح دادند. در  این نوشتار جزئیات دستكاریهای ژنی در ماهیان با ذكر مثالهایی بررسی شده است.

1-1- به كار گیری پروموتر از ژن ماهیان

گزارشهای اندكی در ارتباط با تحقیقات به كارگیری پروموتر از ماهی در دسترس است. در ماهی قزل آلای رنگین كمان دو فرم مشابه از ژنهای متالوتیونین بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بیان  ژن  گزارشگر در محیطهای  كشت سلولی  است. ولی درباره این ویژگی پروموترژن B در سلولهای ماهی اطلاعات كمی وجود دارد. به منظور طراحی و كتورهای مناسب برای ما هی و مطالعه تنظیم بیان ژن در داخل بدن و شرایط آزمایشگاهی پروموترن ژن B متالوتیونین  ماهی قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بیان ژن در لاینهای سلولی انسان و ماهی توسط هونگ (Hong) به كار گرفته شد. به همین منظور وكتور بنام PtMTb – CAT كه دارای 6/4 كیلوباز است طراحی گردید. حدود 261 حفت باز وكتور مربوط به پروموترژن B متالتیونین قزل آلای رنگین كمان (tMTb) كیلو باز آن ژن كلرامفنیكل استیل ترانسفراز (CAT) و سیگنال پلی ادنیلاسیون ویروس SV40 و همچنین 7/2 كیلو باز آن قطعه ای مربوط به پلاسمید PUC₁₈ بوده است همچنین طراحی آن بر پایه ساختمان pBL – CAT تكمیل شده بود. به طوری كه طراحی BL پرایمری دارای سكانس اولیگونكلئوتیدی بر اساس ردیف نكلئوتیدهای سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهی قزل آلا بوده و دارای محل ویژه ای جهت برش توسط آنزیم EcoRI بوده است. همچنین در ساختمان پلاسمید ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازی پروموتر tMTb در جلوی ژن CAT در ساختمان  CAT pBL- قرار گرفته است. در كنار این چهار وكتور دیگر طراحی گردید، كه شامل pBL-CAT₂-1 كه در آن پروموتر تیمیدین كیناز (TK) ویروسی در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT₃-2 بر اساس pBL-CAT₂ كه در آن پروموتر TK برداشته بود طراحی شد pTK-CAT₂E-3  كه در پلاسیمید PBL-CAT₂ تعداد 72 جفت باز تكراری از اینهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتدای ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 كه تعداد 850 جفت باز دارای محل ویژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتیونین II_A انسانی (Hmt_IIA) به ژن CAT در ساختمان
 pBL-CAT₃  اضافه شده بود این وكتورها به روی 4 لاین سلولی ماهی و یك لاین انسانی به كار گرفته شدند. طوری كه در آن سلولها با میزان 5/3 پیكومولار از DNA پلاسمید آلوده شدند جزئیات نتایج در جدول شماره یك آمده است.

جدول 1- سنجش فعالیت پروموتر در یك لاین سلولی انسان و چهار لاین سلولی ماهی

4-3 – جابجایی سلولهای سوماتیك و جنینی به جنین دیگر

هو (Ho) و كان (Kane) در سال 1990 موفق به انتقال سلولهای نشانه گذاری شده طبیعی و جهش یافته ماهی زبرا به دیپلوئیدهای گیرنده شدند تا چگونگی اثر آنها را مطالعه نمایند. لین (Lin) و همكارانش به طور موفقیت آمیز 20 تا 100 سلول رنگ دانه ای یكسان ماهی زبرا را به سلولهای بلاستودرم البینو (فاقد رنگدانه ) گیرنده آن تزریق كردند 23 تا از مجموع 70 تا تالبینو كه به آنها سلول رنگدانه ای منتقل شده بود پس از 4 تا 6 هفته شیمریك ( موجود دارای دو ویژگی متفاوت ) و 18 درصد از سلولها فقط رنگدانه داشتند. آزمایش مشابهی به وسیله نیلسون (Nilsson) و كلود (Cloud) در سال 1992 روی قزل آلای رنگین كمان انجام شد. بر طبق نتایج بدست آمده 1000 سلول نشانه گذاری را تزریق كردند كه فلورسانس (نشانه) در 19 تا از 114 جنین شمریك یعنی به میزان 17 درصد دیده شده است. الگوی توزیع سلولها به طور گسترده ای در جنین شمریك پخش شده بود.

هروت ( Horvath ) و همكارانش سلولهای توتی پوتنت كپور دیپلوئید در مراحل مرولا یا بلاستولا را به یك جنین در مرحله 3 تا 4 سلولی منتقل نمودند تا با نمونه ها دیپلوئید طبیعی مقایسه نمایند. مشاهده شده كه، میزان هاپلوئید برای این منظور مناسب تر است.

برای انجام این انتقال یك كارشناس می تواند در عرض یك ساعت تعداد زیادی از اینها را ایجاد نماید و موفقیت این تكنیك را می توان با یك كاركرژنتیكی ثابت كرد برای این منظور از مطالعه فلس استفاده شده سلولهای گیرنده هاپلوئید از یك ماهی ماده نقره ا بدون فلس (SSnn ) در نظر گرفته شد. در ضمن اینكه سلولهای دیپلوئید دهنده از زاده های ناشی از تلاقی یك نر فلس دار(SSnn ) و یك ماده فلس دار (Ssnn و SSnn)  در نظر گرفته شده اگر بین زاده های ایجاد شد بچه ماهیان دارای فلس وجود داشته باشند این نشان می دهد كه صفت از دیپلوئید دهنده منتقل شده است اگر چه این آزمایش موفق نبوده است ( تصویر 19).

تصویر 18- فرآیند جابجایی هسته در ماهی بالا: خارج كردن هسته از تخم ماهی (a) : جایگاه جسم قطبی و هسته (b) :  ورود سوزن شیشه ای به سیتوپلاسم در جایگاه هسته (c): هسته به وسیله سوزن برداشته شده پایین : جابجایی هسته به تخم ماهی فاقد هسته (a): یك جنین بلاستولایی (b) جداسازی سلولهای بلاستولا در محیط فاقد كلسیم (c): یك هسته از سولولها با پیپت مكش می شود (d) : این هسته با میكرو پیپت به تخم فاقد هسته تزریق می شود.

تصویر 19- سیستم كلونینگ امكان پذیر با استفاده از سلولهای كپور معمولی در جنین مرولایی و بلاستولایی (1) ایجاد تخمك گذاری ژنوتیپ ماده ssnn (آئینه ای ) (2) لقاح (3): كورون زدایی با پروتئاز در مراحل اولیه جنینی (4): جدا كردن سلولهای جنین مرولایی بلاستولایی (5): افزایش سلولها در جنین میزبان 6- انكوباسیونو و مراقبت